L'endroit où se trouve la catacombe de San Sebastiano était dans l'Antiquité une profonde dépression, utilisée comme carrière de pouzzolane et appelée ad catacumbas (ou « près des cavités »), un nom devenu synonyme de cimetière souterrain.

Depuis le premier siècle, le site a été intensément exploité et construit : les galeries souterraines ont été réutilisées pour obtenir des niches funéraires, tandis qu'en surface, plusieurs columbariums ont été construits et au moins deux systèmes résidentiels (la petite villa et la grande villa) dotés de remarquables décorations murales picturales.

Vers le milieu du deuxième siècle, le fond de la vallée a été enterré pour créer un terrain, sur un côté duquel trois mausolées ont été construits successivement (par Clodius Hermes, par les Innocentiores, par les Ax).

Un nouvel enfouissement de la zone a été réalisé pour laisser place à la construction de la triclia, un portique bordé d'un mur sur lequel figurent de nombreux graffitis d'invocations adressées aux SS. Pierre et Paul, qui ont été vénérés ensemble en ce lieu vers 250.

Sur le site, l'empereur Constantin (306-337) a donc fait construire une basilique en forme de cirque romain (appelé « circiforme »).

Entre-temps, dès le troisième siècle, la catacombe qui abritait les tombes des martyrs Sébastien et Eutichio a commencé à se développer sous terre.